Hlutverk sameindasveigjanleika í hitastigsaðlögun subtilasa - verkefni lokið

Fréttatilkynning verkefnisstjóra

20.11.2020

Meginviðfangsefni rannsóknanna eru subtilasar úr kuldakærri Vibrio-tegund (VPR) og aqualysin I (AQUI) úr hitakæru bakteríunni Thermus aquaticus. Þessi tvö ensím hafa samsvarandi þriðja stigs byggingu og henta því einstaklega vel til samanburðarannsókna á hitastigsaðlögun. Stýring á sameinda sveigjanleika er talin gegna lykilhlutverki í aðlögun ensíma að mismunandi hitastigi. Við höfum prófað tilgátur um tengsl sameinda sveigjanleika við hvötunareiginleika og stöðugleika, bæði hjá villigerðum þessara ensíma, sem og meðal mismunandi stökkbreyttra afbrigða þeirra. Spunamerkjum var hvarfað markvisst í hvarfstöð valinna ensímafbrigða með hækkaða hvötunargetu og EPR-mælingum beitt til að meta hreyfingar í hvarfstöð ensímanna. Einnig var flúrljómandi merki hvarfað í hvarfstöð ensímanna, í þeim tilgangi að meta hreyfingar í hvarfstöðinni útfrá breytingum í flúrljómun. Rannsökuð voru áhrif kalsíum bindingar, áhrif innsetninga prólína í lykkjur, áhrif stökkbreytinga Trp í Phe í ákveðnum setum, á hvötunareiginleika, hitastöðugleika og sveigjanleika próteinanna, með aðferðum á borð við Michaelis-Menten hraðafræði, skönnunarvarmamælingum, hringskautunarlitrófsmælinum, flúrljómunarbælingu og tölvuhermunum. Niðurstöður þessara rannsókna sýna m.a. fram á mikilvægi kalsíum bindingar fyrir stöðugleika ensímanna. Jafnframt var sýnt að innsetning Pro í ákveðin set í lykkjum VPR jók hitastöðugleika þess umtalsvert. Einkum voru það set við N-enda próteinsins sem reyndust mikilvæg í þessu tilliti. Rannsóknin leiddi jafnframt í ljós mikilvægi N-enda próteinsins fyrir byggingarlegan stöðugleika próteinsins. Sett var fram líkan fyrir VPR sem sýnir byggingu sem er mjög samheldin og afmyndast sem ein heild. Þessa samheldni byggingarinnar má trufla, t.d. með því að veikja kalsíum bindingu, eða með stökkbreytingum sem hafa áhrif á hvernig N-endi próteinsins hefur áhrif á aðra hluta byggingarinnar. Sumir innansameindakraftar virðast vera styrktir með prólín innsetningunum, sem virðast verka sem eins konar akkeri sem skorða lykkjusvæði og viðhalda réttum sameindahrifum við hærri hitastig. Niðurstöður okkar veita dýpri sýn á eiginleika hraðafræðilegar stöðgunar, áhrifa samheldinna afmyndunarferla á stöðugleika, hvernig prólín hafa áhrif á sameindahrif milli fjarlægra svæða innan prótein-byggingarinnar og hvernig kalsíum binding á mismunandi bindisvæði hefur áhrif á mismunandi eiginleika próteinanna.

English:

The aim of the research project has been to elucidate some of the structural principles underlying temperature adaptation among subtilisin-like serine proteinases (subtilases). The main focus of the research are subtilases from a psychrophilic Vibrio-sp. (VPR), and aqualysin I (AQUI), from the thermophile Thermus aquaticus. These homologous enzymes have highly similar 3D structures and are therefore an ideal model system for studying structural aspects of temperature adaptation. Adjustment in molecular flexibility is thought to play a key role in the temperature adaptive strategies of enzymes. We have tested different hypotheses regarding the relationship between molecular flexibility and catalytic properties and stability, both for the wild type as well as different mutants of the enzymes. We used site directed spin labelling of active sites of selected mutants and EPR measurements, in an attempt to measure differences in flexibilities at the active sites of the enzymes. We also labelled the active sites of selected mutants with a fluorescents probe in order to monitor active site movements by changes in fluorescence. We studied the effect of calcium binding, the effects of insertion of proline residues into loops, the effects selected Trp to Phe exchanges, on the catalytic properties, thermal stability and molecular flexibility, using approaches such as Michaelis-Menten kinetics, differential scanning calorimetry, circular dichroism spectroscopy, fluorescence quenching and molecular dynamic simulations. The results of these studies demonstrated the importance of calcium binding for the structural stability of the enzymes, Furthermore, they showed that the insertion of prolines into loops of VPR significantly increased its thermal stability. Incorporation of two prolines at sites close to the N-terminus of the enzyme were especially effective in that respect. Furthermore, the showed the general importance of the N-terminal region for structural stability of the protein. A model was proposed of a native structure that unfolds in a highly cooperative manner. This cooperativity can be disrupted, however, by modifying calcium binding of the protein or by mutations that affect interactions of the N-terminal region with other parts of the protein molecule. The N-terminus likely acts as a kinetic lock that infers stability to the rest of the structure through different interactions. Some of these interactions may be strengthened via proline residues, that seemingly act as anchor points that tend to maintain correct orientation between these parts of the protein as thermal energy is increased in the system. Our results give a deeper insight into the nature of kinetic stability, the importance of cooperativity during unfolding of kinetically stable proteases, synergy between distant parts of the protein through proline mutations and how different calcium binding sites have vastly differing roles.

Heiti verkefnis: Hlutverk sameindasveigjanleika í hitastigsaðlögun subtilasa/The role of molecular flexibility in temperature adaptation of subtilases
Verkefnisstjóri: Magnús Már Kristjánsson, Háskóla Íslands
Tegund styrks: Verkefnisstyrkur
Styrktímabil: 2016-2018
Fjárhæð styrks: 30,555 millj. kr. alls
Tilvísunarnúmer Rannís: 162977